Concepts et Techniques





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Janvier 2002

n°191
Tous mes vœux pour la nouvelle année.

Ce bulletin est volontairement généraliste et essaye d'attirer l'attention sur des données pouvant avoir un impact en biotechnologie, surtout appliquées aux productions agricoles, à leur transformation et à l'environnement. Il cherche à équilibrer anticipations et réalisations concrètes. Il abandonne généralement les sujets, souvent importants, traités dans votre quotidien habituel ou la presse hebdomadaire.

Le champ étant quand même large et mes compétences limitées, des erreurs se glissent inévitablement dans mes analyses, les choix ne sont peut-être pas toujours pertinents; je m'en excuse auprès des lecteurs, mais l'accès aux revues n'est pas toujours facile dans ces temps d'inflation des prix d'abonnements. Je lis, d'ailleurs, avec intérêt les commentaires ou critiques qui me sont communiqués.

Certaines explications, inutiles pour les "lettrés", le sont cependant pour les "analphabètes" curieux, je les insère souvent après lecture des épreuves du bulletin par certains de ces analphabètes. Je m’en excuse auprès des "lettrés".

Etant obligé de limiter la diffusion initiale du document-papier pour des raisons pratiques, j'encourage une distribution plus large par les destinataires. Nous faisons un effort, avec ma collègue administrative Patricia Laplagne, pour rendre la version internet plus accessible, compte tenu de son volume non négligeable.

Comme je le laissais transparaître en Janvier dernier, un système d'alerte de la parution du bulletin a été mis en place ces derniers mois. Profitez en. André BERKALOFF

e-mail : andre.berkaloff@igmors.u-psud.fr

Une version plus complète de ce bulletin est accessible sur le site de l'INRA www.inra.fr. sous son nom dans : Information Scientifique et Technique puis Publications INRA en ligne.

Le signe ### dans cette version papier indique quelques développements supplémentaires ou des commentaires additionnels consultables dans la version électronique.

Concepts et Techniques


1. La revue de RJ Ellis; Trends in Biochemical Sciences 26 (OCT01) 597-604###, aborde à nouveau le thème de l'énorme densité des macromolécules dans la cellule. La concentration de chacune d'entre elles n'est pas forcément élevée, mais l'ensemble atteint des concentrations de l'ordre de 300 à 400 g. par litre dans une cellule d'Escherichia coli (soit 20 à 30% du volume)..

L'effet principal de l'encombrement sur l'équilibre des réactions est de favoriser l'association de macromolécules. Il est fortement non-linéaire par rapport à la taille et la concentration des molécules qui interagissent. Le volume alloué à une macromolécule compte tenu de la densité et de taille des autres molécules fait que sa concentration effective est parfois très supérieure à celle que l'on mesure globalement.

Le rapport entre ces deux concentrations est appelé le coefficient d'activité, car plus il est élevé plus les molécules sont tassées entre elles, plus la réaction va être stimulée (parfois de 2 à 3 ordres de grandeur). C'est, en effet, la concentration effective qui intervient sur l'équilibre des réactions.

L'auteur discute des conséquences expérimentales, notamment pour la prévention de l'agrégation des protéines.

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4. Un article de chercheurs israéliens rappelle que, quand on mesure l'activité transcriptionnelle d'un promoteur dans un montage plasmidique avec un gène marqueur, on oublie que ce montage doit, auparavant, accéder au noyau. En fait les éléments régulateurs jouent également, et dans certains cas, sur la translocation du plasmide dans le noyau.

Ce processus fait intervenir des facteurs de transcription et autres protéines possédant des séquences de ciblage nucléaire. On peut donc surestimer la "force" du promoteur quand il sera intégré dans les chromosomes. M Zohar et al.; BioEssays 23 (DEC01) 1176-1179.

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5. Il subsiste toujours des doutes sur la stimulation de l'expression génique par les MARs (Matrix Attachment Regions). Un article indique, qu'effectivement, une MAR, RB7, du tabac a un effet beaucoup plus grand en cultures de cellules que dans la plante. On retrouve le parallèle avec l'effet positif des MARs sur l'expression de transgènes dans les tissus embryonnaires de la souris, mais pas dans les tissus adultes.

Des chercheurs de Raleigh ont essayé de démêler cette affaire. Ils ont analysé l'expression d'une construction 35S::GUS avec ou sans MARs flanquantes dans des cellules en suspension issues de plantes transgéniques pour cette construction. Ils ont comparé les niveaux d'expression dans les cellules, et dans les plantes dont elles sont issues. La présence des MARs n'affecte pas sensiblement l'expression dans les cellules en suspension, et ce n'est donc pas l'aspect indifférencié et les divisions rapides qui interviennent sur l'expression. W Van Leeuwen et al.; Plant Molecular Biology 47 (NOV01) 543-554.###

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6. On trouvera dans YF Leung et al.; Trends in Biotechnology 19 (DEC01) 480-481, un compte rendu du colloque "Cambridge Healthtech Institute’s Fifth Annual Proteomics – From Proteins to Drugs of Beyond Genome 2001" qui s'est tenu à San Francisco les 21 et 22 Juin

Alors que, jusqu'à récemment, le terme de protéomique se référait presqu'exclusivement aux profils d'expression en électrophorèse 2D, suivie de spectrométrie de masse pour analyser les protéines séparées, de nouveaux types d'analyse comme celle des interactions protéiques grâce aux hybrides à deux composants sont maintenant utilisées massivement, et de façons diverses. L'exploitation de cette technique a été commentée par Hybrigenics (de Paris) et Myriad Genetics. Les réseaux protéiques se répandent. Phylos Inc., Molecular Staging Inc., Ciphergen Biosystems Inc. et Large Scale Proteomics Corp. ont décrit leurs techniques de réseaux protéiques. Le profilage phylogénique est basé sur la montée rapide des données génomiques et de la puissance des techniques d'exploitation de ces données.

Pour supplanter la technique d'électrophorèse 2D, trop coûteuse en main d'œuvre et en expertise, plusieurs techniques sont en cours de développement dont certaines ont été signalées, en leur temps, dans ce bulletin.

John Yates (Scripps Research Institute) développe une technique de chromatographie liquide multidimensionnelle (multidimensional protein identification technology ou MudPIT). La multiplication de colonnes différentes permet de disposer de plusieurs dimensions facilitant la résolution. L'utilisation de colonnes d'affinités différentes permet, par ailleurs, l'analyse sélective de complexes ou l'association de protéines. Mais l'énorme avantage potentiel est la possibilité d'automation. SurroMed a décrit sa technique de code barre (voir le Bulletin de Février 2000).

Ciphergen a décrit sa technique de (SELDI)-TOF-MS (Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization-Time Of Flight-Mass Spectrometry), dérivant de la technique MALDI-TOF. La surface chromatographique retient spécifiquement certaines protéines qui sont ensuite analysées. Elle permet un profilage de l'expression protéique et des interactions entre protéines ou de protéines avec d'autres macromolécules.

Structural GenomiX Inc. a décrit sa technique d'élucidation à haut débit (grâce à des robots) des structures protéiques. Structural GenomiX Inc. associée à l'Advanced Photon Source (synchrotron) de l'US Department of Energy permet d'établir les structures de centaines de cristaux protéiques (ou de protéines associées à des ligands) par semaine à l'échelle atomique. Voir également §143 de ce bulletin.

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8. On trouvera dans CS Pikaard; Trends in Genetics 17 (DEC01) 675-677, une revue sur les remaniements du fonctionnement du génome après une duplication (voir le Bulletin de Novembre 2001 §7). Une hybridation ou une duplication perturbent instantanément les régulations cellulaires. Des études récentes, surtout effectuées chez les plantes ou cela est plus aisé à réaliser expérimentalement, ont montré que la perturbation est immédiatement suivie par l'entrée en action d'une série de mécanismes génétiques et épigénétiques, avec élimination de séquences et d'extinction de l'expression (silencing). Ceci a lieu, contrairement à des idées reçues sur la lenteur de l'évolution, dès le premier stade polyploïde. Les hybrides diploïdes sont souvent un cul de sac du fait des défauts d'appariements à la meïose (type mulet). Une autopolyploïdisation précédant ou suivant immédiatement le croisement supprime ce problème. De tels évènements ont été fréquents chez les plantes, et ont transformé des espèces peu productives en espèces adaptées aux besoins de l'homme, comme les blés, les crucifères ou le coton. La reconstitution de ces polyploïdes a été possible, compte tenu de la tolérance de plantes à ces jeux de la nature. On constate cependant un choc génétique quand on réalise l'opération, avec perturbation des régulations, dont une manifestation est la libération fonctionnelle de transposons, par exemple.

Mais c'est la solution rapide des contradictions ainsi engendrées qui facilite leur stabilisation. Elle passe par une réorganisation des boucles de régulations avec "silencing" de certains gènes perturbants, l'élimination de gènes dont la redondance n'est pas souhaitable, et la mise en œuvre de mécanismes assurant une fidélité des appariements lors de la meïose.

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9. Posséder des récepteurs périphériques et des transporteurs est bien pour une cellule, mais encore faut-il qu'ils soient accessibles à leurs ligands. Ceci est particulièrement vrai des épithéliums dont les cellules polarisées possèdent une face apicale vers l'extérieur et une face basale vers l'intérieur, en sus des faces latérales qui les associent à leurs voisines. Elles disposent donc vraisemblablement de signaux de localisation dans la membrane plasmique amenant les protéines au bon endroit. Le transporteur de la dopamine est logé sur la face apicale dans les cellules épithéliales, tandis que celui de la norépinéphrine est localisé sur les faces baso-latérales. Tout dépend de l'extrémité N-terminale, qui est hautement divergente, alors que le reste de la molécule est très voisin. HH Gu et al.; Molecular Biology of the Cell 12 (DEC01) 3797-3807.

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10. Les éponges sont les plus anciens métazoaires (600 millions d'années) survivants. Elles utilisent déjà une ADP-ribosyl cyclase qui convertit le NAD+ en ADP ribose cyclique. Elle est activée par un mécanisme induit par l'acide abscissique (une des hormones végétales) via un mécanisme dépendant de la protéine kinase A lors d'une élévation de température. C'est un canal à cations tout à fait similaire à celui à K+ des mammifères, qui est activé par ce messager ADP ribose cyclique. Ce canal thermocapteur est sensible à toutes sortes de stress. L'acide abscissique et l'ADP ribose cyclique sont des messagers utilisés par les plantes lors du stress hydrique. E Zocchi et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 98 (18DEC01) 14859-14864.

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11. L'âge d'anciens ADNs est facilement surestimé. Un des facteurs est la présence de désoxycytidines modifiées dans les rares molécules copiables lors de la PCR, et qui donnent lieu à des substitutions CT et GA. De plus les changements de molécules copiées en cours de PCR augmentent les risques de cumul d'erreurs. On augmente donc artificiellement, lors de l'amplification, la divergence évolutive apparente. Il faut donc répéter les amplifications sur des clones indépendants. En multipliant les précautions de ce type, on peut abaisser le taux d'erreurs à moins de 0,1%, même si on part d'une seule molécule initiale. M Hofreiter et al.; Nucleic Acids Research 29, 23 (DEC01) 4793-4799.

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