Iii° La chromatographie de partage en phase inverse





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Chapitre N°6
Le Greffage
La Chromatographie de Partage

Sommaire
I°) Introduction page 3
II°) Le greffage page 4
21 La réaction de greffage

22 Le ‘End-Capping’
III°) La chromatographie de partage en phase inverse page 6
31 La phase stationnaire

311 Longueur et diamètre de colonne

312 La nature du greffon

313 Le nombre de greffons

314 Surface hydrocarbonée

32 La phase mobile

321 Rôle de l’eau

322 Rôle de la composante organique

323 Développement isocratique et en gradient d’élution

33 Les solutés

331 Le partage dans le système octanol / eau

332 Les paramètres de solubilité

IV°) Les constituants de la chaîne HPLC page 14

41 Les pompes
42 L’injection

43 La détection

431 Généralités

432 Les différents détecteurs

433 Les détecteurs absorptiométriques

434 Réfractomètre et DDL

435 Les autres détecteurs

V°) La dérivatisation page 21
51 Dérivatisation pré colonne

52 Dérivatisation post colonne
VI°) Les autres techniques chromatographiques page 23

61 L’appariement d’ions

62 La chromatographie chirale

63 La perméation de gel

64 L’échange d’ions

I°) Introduction
Comme on l’a vu dans le chapitre précédent, la chromatographie d’adsorption présente ses limites et ses contraintes, que ce soit au niveau de la polarité de la phase stationnaire, dans son maintien d’état d’activité et dans la préparation des phases mobiles. Dés le début du XXème siécle, après les travaux de Tswett, les scientifiques ont utilisé, en colonne ouverte, une multitude de supports chromatographiques, (brique pillée, verre…) pour tester leur aptitude à interagir avec des solutés, le tout s’étant soldé par une concentration de réflexion sur les silices et les alumines.
Hors cet aspect était limitatif, en tant qu’interactions, du fait de la polarité de la phase, les chercheurs ont tenté de modifier celle-ci en adsorbant des composés très polaires (amines, polyols…) à la surface de celle-ci.  Ils ont obtenu, ainsi, des phases stationnaires de polarité différente permettant d’accroître leur champ d’investigation. On peut citer par exemple, l’adsorption de polyamines ‘lourdes’ polyfonctionnelles qui s’adsorbaient ‘irréversiblement’ à la surface des silices, par liaisons hydrogènes, et qui conduisaient à l’obtention de ‘nouveaux supports chromatographiques’. Cette technique présentait des avantages, au niveau du laboratoire, car elle permettait d’obtenir ‘in situ’ des phases de polarité diverses, à la discrétion de l’opérateur. A partir d’une silice nue, il pouvait ‘créer’ une phase stationnaire adaptée à son problème.
En contrepartie, elles avaient leurs inconvénients : Le principal est lié à l’effet de ‘Bleeding’ lié à la désorption de l’entité adsorbée sur le support siliceux.. En effet, sous l’action du flux de phase mobile et des forces que cela génère, l’espèces adsorbée, au cours du temps, était désorbée de la surface et éliminée de la colonne chromatographique, ce qui conduisait, à terme, à l’obtention d’une colonne de silice nue. Il s’ensuivait des problèmes de reproductibilité des analyses qui ne pouvaient être transposables à l’échelle du contrôle.
Pour résoudre cette difficulté, il fallait pouvoir ‘immobiliser’ ces entités à la surface du support. Dans les années 1970, la technique d’immobilisation, par greffage, a été suffisamment maîtrisée pour être développée et commercialisée.
Le second aspect de l’évolution de ces techniques chromatographique est lié à la technicité. En effet, l’amélioration des résolutions chromatographiques passait par l’utilisation de supports de granulométrie plus petites (en colonne ouverte, on utilise classiquement des granulométrie de plusieurs dizaines de microns). Hors ces granulométries plus petites génèrent des pertes de charges très importantes (loi de Darcy : la perte de charge est inversement proportionnelle au carré du diamètre des particules) et on ne disposait pas de système de pompage permettant d’assurer des débits constants (classiquement 1 ml/mn) sous des pressions de plusieurs centaines de bars. Il fallut attendre l’évolution de la mécanique pour pouvoir disposer de pompes fiables répondant à ces critères, ce qui fut réalisé dans les années soixante

( ceci explique le terme originel de HPLC : chromatographie liquide haute pression, les pressions appliquées en tête de colonne étaient alors de l’ordre de 400 bars).
La conjonction de ces deux phénomènes a vu l’explosion de cette technique dans les années 1970 et son développement pour en faire, aujourd’hui, une technique de contrôle, que l’on peut qualifier d’incontournable.

II°) Le greffage des silices
21 La réaction de greffage
Deuxième étape de cette évolution, le greffage constitue une pierre angulaire du développement de la chromatographie et de sa terminologie.
Pour simplifier le problème, le greffage a consisté à immobiliser, par création d’une liaison chimique covalente, une entité sur un support siliceux. Divers types de greffage ont été utilisés avec plus ou moins de satisfaction : On ne retiendra que, c’est le plus stable et le plus utilisé, que le greffage par les silanes. Il consiste a créer une liaison Si-O-Si entre un silanol du support siliceux et le silicium d’un dérivés sillylé adapté suivant le schéma réactionnel :


R1, R2 et R3 pouvant présenter n’importe quelle fonctionnalité. D’une manière générale, Un des substituants, R3 du dérivé sillylant, porte la fonctionnalité que l’on veut introduire sur le support siliceux, les deux autres (R1 et R2) étant, soit des halogènes soit des fonctions étheroxydes qui s’hydrolysent pour libérer des silanols  ce qui conduit à des phase stationnaires du type :



Suivant la nature de R3, on peut, par ce biais, obtenir des phases stationnaires de polarités très étendues. Historiquement, les premières phases greffées présentaient un radical

R3 = octadécyl (C18H37). Depuis, la nature des greffons s’est largement étoffée : On rencontre classiquement des greffons de type alkyl (C8H17, C3H7 , C2H5) de type phényl (C6H5), de type amine (C3H6NH2…), nitrile (C3H6CN) et autres polyols (propylène glycols….).
On comprendra aisément que l’on peut (c’est pas toujours simple…) greffer n’importe quelle fonctionnalité sur un support siliceux par ce type de mécanisme et ainsi obtenir une palette de phases stationnaires de fonctionnalité et de polarité différentes. Cet aspect est largement utilisé de nos jours à l’échelle du laboratoire (synthèse de phases chirales…) et à l’échelle du laboratoire de contrôle (commercialisation d’un grand nombre de supports greffés aussi bien en colonne qu’en plaques CCM).
Le greffon étant physiquement liquide, on ne parlera plus de chromatographie d’adsorption (chromatographie liquide-solide) mais de chromatographie de partage(chromatographie liquide-liquide) entre une phase liquide (la phase mobile) et une phase liquide (le greffon) immobilisée sur un support solide.

A ce propos, on observe actuellement un large développement de supports non plus siliceux mais polymériques (co-polymères styrène-divinyl benzène) qui présentent certains avantages par rapport aux silices (on va rapidement comprendre pourquoi).

Comme on vient de le voir, cette notion de greffage et de silices greffées introduit un nouveau concept en terme de chromatographie : Le partage. Pour bien comprendre la terminologie utilisée, on doit se replacer dans le contexte technique : A l’origine, on utilisait un support polaire (phase stationnaire que ce soit des silices ou des alumines) et des phases mobiles peu polaires. On parlait alors de chromatographie en phase normale. Avec l’apport du greffage (et notamment des phases octadécyle C18), on a utilisé des phases stationnaires apolaires avec des phases mobiles, au contraire, très polaires, d’où le concept de chromatographie en phase inverse qui s’est largement répandu et que l’on développera dans le paragraphe suivant. On peut cependant, dès à présent dresser un tableau d’application de cette chromatographie de partage en fonction de la nature du soluté et des polarité des couples (phase mobile / phase stationnaire) utilisés :


Soluté

Polaire

Moyennement polaire

Moyennement polaire

Peu et apolaire

Eluant

Moyennement polaire

Faiblement polaire

Fortement polaire

Moyennement polaire

Exemple

CH2Cl2/Hexane 80/20 (v/v)

CH2Cl2/Hexane 5/95 (v/v)

CH3OH/H2O 40/60 (v/v)

CH3OH/H2O 90/10 (v/v)

Phase stationnaire

Silice greffées polaires

NH2, CN, Diols

Silices greffées polaires

NH2, CN, Diols

Silices greffées peu et apolaires

Phényls, C18, C8

Silices greffées peu et apolaires

Phényls, C18, C8

Type de chromatographie

Partage en phase normale

Partage en phase normale

Partage en phase inverse

Partage en phase inverse



Avant de développer la chromatographie de partage en phase inverse, il est bon de compléter cet aspect greffage par le traitement que doivent subir ces supports afin de conduire à des chromatogrammes de bonne qualité. On comprendra aisément que lors de cette étape de greffage, tous les silanols de la surface du support siliceux ne seront pas atteint par le réactif sillylant. Il s’ensuit qu’il va en rester et que ceux-ci resteront des sites potentiels d’adsorption, ce qui peut conduire à des interactions néfastes (traînées de pics chromatographiques..). On résoud ce problème par le traitement de ‘End-capping’.
22 Le ‘End-capping’
Afin d’éliminer (partiellement) ces silanols résiduels (après greffage), les supports siliceux sont traités pat un agent sillylant à chaîne courte (le TMCS, Triméthyl Chlorosilane, en général), qui à l’avantage, par sa taille, de pouvoir réagie chimiquement, avec les silanols qui ne pourraient le faire par gêne stérique :

A l’issue de ce traitement, la surface du support présente donc des sites greffés par l’entité choisie(octadécyl par exemple) des sites end-cappés et des silanols résiduels qui ne sont pas accessibles aux molécules de triméthylchlorosilane. La présence de ces derniers ne gêne pas l’analyse chromatographique dans la mesure ou n’étant pas accessible à la molécule de TMCS, il ne le seront pas, non plus, aux molécules de solutés. On peut donc schématiser la surface finale du support chromatographique (dans le cas d’une silice greffée octadécyle) :

Pour conclure sur ce thème du greffage, on notera que dans le cas de petits greffons (C2, C3…) on a recours à un ‘spacer’ (bras) pour éloigner celui-ci de la surface du support siliceux et favoriser ainsi les interactions spécifiques entre le greffon et le soluté.
Comme on a pu le constater dans ce paragraphe, le greffage s’est considérablement développé autour du concept de phase inverse. L’apparition de ce type de phase dans les années 1970 a révolutionné le monde la chromatographie et cette technique a supplanté l’adsorption au point que 80 % des séparations chromatographiques sont aujourd’hui réalisées par chromatographie de partage en phase inverse. Ce qui justifie le paragraphe suivant.
III°) La chromatographie de partage en phase inverse.
Pour illustrer cette technique, on s’appuie sur la norme analytique concernant le dosage d’hydrocarbures aromatiques polycycliques ( P.H.A : µ polluants) dans l’eau (NF T 90-115).

La structure des six PHA quantifiés est présentée ci-dessous :






La méthode met en œuvre :


  • Une phase d’extraction au cyclohexane

  • Une phase de concentration (1 ml) sous pression réduite

  • Une phase de purification sur colonne d’alumine

  • Une phase de concentration et reprise à 1 ml de solvant

  • Une analyse pare chromatographie HPLC


La phase d’extraction est réalisée sur une eau brute (volume V1 = 250ml) par 25 ml de cyclohexane, à l’abri de la lumière, les PHA étant sensibles à la photo-oxydation. Après séparation des phases organiques et aqueuses, la fraction organique est séchée sur sulfate de sodium anhydre puis concentrée à environ 1 ml sous pression réduite.
Dans la phase de purification, on utilise une colonne d’alumine préalablement activée (séchage à 550°C dans un four pendant 2h) puis conservation dans un flacon avec 6% d’eau. On retrouve ici, cette notion d’activation et d’isohydrie du support évoquée dans le chapitre précédent. A partir de ce support, une colonne (200 mm, diamètre 6 mm) est réalisée. L’extrait, précédemment obtenu est déposé en tête de colonne, puis élué par du cyclohexane. Les six HAP étant de nature très peu polaires, les impuretés restent fixées sur la colonne chromatographique et les HAP éluent avec le solvant comme schématisé ci-dessous :


Solution Cyclohexane




Cyclohexane










HAP + impuretés




Impuretés


Gel d’alumine






Gel d’alumine










Eluat = Cyclohexane




Eluat = Cyclohexane + HAP

1ere phase 2nde phase


La fraction cyclohexanique est recueillie puis concentre sous vide à sec. Le résidu est repris par 1 ml de méthanol CH3OH (ou d’acétonitrile CH3CN) pour être chromatographié par HPLC.

L’analyse chromatographique de cet échantillon est réalisé dans les conditions suivantes :

- Phase stationnaire : Silice RP18 ou Lichrosorb C18 L = 250 mm  = ¼’’

- Injection 20 µl

- Phase mobile : CH3CN / H2O 85/15 Débit : 1 ml mn-1

- Détection : Flurorimétrique : excitation = 360 nm émission > 420 nm
Ces différents termes concernant l’analyse appellent quelques commentaires concernant la technique en elle-même et le matériel utilisé. C’est ce que nous allons développer dans les paragraphes suivants.
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