Proteines rappel : Propriétés physico chimiques





télécharger 89.17 Kb.
titreProteines rappel : Propriétés physico chimiques
date de publication11.02.2017
taille89.17 Kb.
typeDocumentos
d.20-bal.com > droit > Documentos

LV303 – Protéines – Dernière mise à jour 29/09/08

BIOCHIMIE

PROTEINES 2

Rappel : Propriétés physico chimiques 2

1.Rappel : Structure 3D et quaternaire 2

2.Lien entre la structure 4D et liaison d’un ligand sur une protéine 3

Définition d’une structure quaternaire 3

Intro en enzymologie 3

3.Modification post-traductionnelles des protéines 7

Formylation 7

ENZYMOLOGIE 9

Rappels 9

Notion de cinétique chimique 9

Notion d’état de transition 10

Michaelis 11

Notion d’inhibitions réversibles 15

Inhibiteur compétitif 15

Inhibiteur non compétitif 18

Inhibiteurs incompétitifs 19

Remarque inhibitions 20

Cas inhibiteurs par excès de substrats 20

Réactions réversibles 22

Réaction à 1 substrat et plusieurs complexes intermédiaires 24

Réaction à plusieurs substrats 26

Notation de Cleland : 26

Association non ordonnée (NO) :Réaction séquentielles aléatoire (ex : bibi aléatoire) 27

Association séquentielles ordonnée (O), A= substrat obligatoire 28

Mécanisme ping pong (avec complexe ternaire) 28



PROTEINES

Rappel : Propriétés physico chimiques



Loi de Hendersson-Hasselbach
Les aa catalitiques sont tjs ionisables : AH = A- + H+
Ka = ([H+] * [A-]) / [AH]  [H+] = Ka[AH] / [A-]
 pH = - log [H+] = - log Ka – log ([AH] / [A-])

 pH = - log Ka + log ([A-] / [AH])

 pH = pKa + log ([A-] / [AH])

 pH = pKa + log ([accepteur] / [donneur])
 pH - pKa = log ([A-] / [AH])
 ([A-] / [AH]) = 10(pH – pKa)
A savoir [A-] + [AH] = 100% = 1 et pHi = f(% de [A-] ou de [AH])

  1. Rappel : Structure 3D et quaternaire



= conformation NATIVE et ACTIVE structurée par des forces (voir tableau)


Forces

Exemple

Energie de liaison* en kJ/mol

Van der Waals = liaison entre couche ext. Et noyau d’atomes très proches

C-H … H-C

1-5 (faibles mais nombreuses)

Liaison H

-N-H…O=C-

10-20

Electrostatiques (ioniques)

-COO-+NH3-

12-20

Interaction hydrophobes = déplacement d’un -CH2- (hydrophobe) d’un environnement aqueux vers un environnement sans ou avec peu d’eau, soit déplacement d’un -CH2- vers l’intérieur de la protéine



12-15


* Energie (E) de liaison = E nécessaire pour briser une liaison

  1. Lien entre la structure 4D et liaison d’un ligand sur une protéine



 Un monomère possède aussi une structure quaternaire monomérique car il y a interaction entre les domaines de la protéine.

Définition d’une structure quaternaire



 nombre de sous-unités (s/u) : αxβy

 nature des s/u

 interactions entre les s/u
exemple : Hémoglobine Hb = α2β2 avec 4 hèmes , α et β ont des homologies, 4 oxygènes peuvent se fixer

Intro en enzymologie





¤ Notion de quasi-équilibre = lorsque k+2 <<< k-1 , alors on dissossie plus qu’on ne va vers la catalyse
Km = (k-1 + k+2) / k+1
Le Km est l’affinité pour le substrat et la concentration ([c]) nécéssaire pour arriver à la moitié de la Vmax.
¤ Notion de constante de dissociation = KD = k-1 / k+1

(Dissociation k-1 k+1)
¤ Donc les conditions de quasi-équilibre s’appliquent lorsque :

Km = (k-1 + k+2) / k+1 = KD

¤ L’équilibre parfait  k+2 = 0 : les conditions d’équilibre parfait concernent souvent les molécules de transport telles que l’Hb.

¤ Cas d’une protéine à 1 site de liaison




KD = k-1 / k+1 = ([P] [L]) / [PL]
[P] : [protéine libre]

[L] : [ligand libre]

[PL] : [protéine liée] = [ligand lié]


υ = nb moyen de ligands liés par des protéines = nb de site occupé
υ = [PL] / [Po] = [ligand lié] / [protéine totale] = [L lié] / [Eo]
or [Po] = [P] + [PL] et KD = ([P] [L]) / [PL]  [P] = KD[PL] / [L]
d’où υ = [PL] / ([P]+[PL]) = [PL] / ((KD[PL]/[L]) + [PL])+[PL])

par simplification υ = 1 / ((KD/ [L]) + 1)
υ = [L] / (KD + [L])

¤ Cas d’une protéine à n site de liaison
υ = n [L] / (KD + [L])  vi = Vmax [S0] / (Km + [S0])



(nombre de site oqp) υ


Mesure que l’on peut faire en TP




¤ Linéarisation de Scatchard



υ/[L]

υ/[L] = n/KD –υ/KD= f(υ)

Mesure que l’on peut faire en TP


vi/[So] = Vm/Km – vi/Km = f(vi)


¤ Autre linéarisation




υ = [L liés] / [Eo] = n [L] / (KD + [L])
υ / [L] = [L liés] / ([Eo] [L]) = n / (KD + [L])
[L liés] / [L] = n [Eo] / (KD + [L])
[L liés] (KD + [L]) = n [Eo] [L]
[L liés] KD = n [Eo][L] - [L liés][L]
[L liés] / [L] = n [Eo]/KD - [L liés]/KD
¤ Exemple d’application en TP
=> Déterminer la portion de substrat libre !
Rappel : lorsqu’on trace vi=f([S]) on fait une approximation [S] = [So] car on suppose que le substrat est en excès est donc tjs proche de [So]

 Attention on ne peut pas faire cette approximation avec Scatchard

=> Méthode expérimentale




Ligand total = [Lo*]

Observable = Radioactivité
Compartiment 1 :

Po ne franchit pas la barrière formée par la mb
Compartiment 2 :

Lo franchit la mb par diffusion jusqu’à l’atteinte de l’équilibre où L1* = L2*
On prélève le même volume dans le compartiment 1 et 2.
Compartiment 1 => radioac R1

Mesure de R1 = PL*+L1*
Compartiment 2 => radioac R2

Mesure de R2 = L2*
A l’équilibre L1*=L2*
On a donc :

  1. Modification post-traductionnelles des protéines



Ribosomes + ARNm + ARNt aminoacylés + énergie (ATP, GTP) + nbx facteurs protéiques + enzymes …

Formylation




Chez les procaryotes





Groupement formyl

Méthionine bloquée par le grt formyl

N-formyl-Met-aa2-aa3-Ct

 Il n’existe pas tjs la met sur les protéines matures !
exemple : Chez Coli seulement 40% des protéines ont une Met en Nt donc il existe 2 enzymes responsable de cette modif post-trad :


  • la méthionine déformylase

  • méthionine amino peptidase



Chez les eucaryotes


On commence avec une mét non formylée

But



Méthionineaminopeptidase (MAP)
Observation chez E.Coli

Si Aa n°2 gros aa (Tyr , Trp, Phé, Mét) alors Mét n°1 n’est pas clivée.

Si Aa n°2 petit aa (Ser, Gly, Thr, Cys) alors Met n°1 est clivée => maturation, modif post trad.
L’enlèvement de la met permet de déterminer la demi vie de la prot (durée de vie de la prot dépend de l’acté Nt car il s’y trouve petite protéine UBIQUITINE (ubiquitaire) = étiquette donnant durée de vie est fixée sur exté Nt.
Séquence PEST présente à l’exté Nt d’une prot= Séq riche en proline, ac glutamique, sér ou Thr => durée de vie de moins de 2 heures
TURNOVER de protéine qui contrôle la [c] de la prot = processus qui décrit la dégradation et la re$ continuelle d’une prot dans la cellule.
Demi vie = tps qu’il faut pour obtenir la dégradation de la moitié de la qté cellulaire d’une protéine.
Les prot qui ont une Mét en Nt ont une durée de vie plus longue.

Les protéines structurales comme le collagène a une longue durée de vie.

Les enzymes de régulation ont une durée de vie de quelques minutes.
Exemples : Hémoglobine (1/2 vie de 100 j ; ARNpol 1,5min )

Phosporylation



Serine, thréonine et tyr peuvent être modifiés en les phosphorylant

Cf schéma 1

Ajout de sucre



sur chaine lat (Asn, Gln)

Fixation de cofacteur


Ex : FAD, biotine, hème

Hydroxylation


Sur pro et lys

ENZYMOLOGIE




Rappels




Notion de cinétique chimique



nA +nB => pC +qD
k = cte de vitesse
[C]=c

Apparition de C

v=(c2-c1)/(t2-t1)=dc/dt= delta c/delta t = pente

Disparition de A
v=- d a/d t

L’ordre d’une réaction par rapport au temps



nA => n’A’

k=cste e vitesse
v=- d a/d t = k [A]n= => log v = log k + n log [A]
Vitesse correspondant à différents temps => utilisation des tangentes
Cf feuille
Ordre partiel : n par rapport à A ; m par rapport au substrat B
Ordre globale de la réaction : n+m = nombre de molécules de A et de B qui interagissent.

L’ordre par rapport à la [c] initiale de A



Graph
Faire les deux méthodes pour être sûr de l’ordre de la réaction

Notion d’état de transition



ΛG=ΛGprod – Λgréactants or Gréact>Gprod
ΛG< 0 => réaction spontanée
Exemple :
2 H2O2 = 2 H2O + O2 Réaction thermodynamiquement favorable mais très lente
Ea = énergie d’activation = barrière d’E pour amener réactant de l’état initiale à l’état de transition
Exp : solution à 3% : H2O2 dans H2O à 37°C avec dégagement lent de 02.

graph………..
ΛG = ΛH dans les conditions où l’entropie n’intervient pas
Si on veut accélérer la vitesse de la réaction :


  1. Favoriser l’état de transition, la proba de rencontre en chauffant

  2. Ajout catalyseur chimique (Fe3+) (augment 30000 fois la vitesse)

  3. Ajout catalyseur biologique (catalase augmente d’un facteur 108) : baisse l’Ea


Comment l’enz diminue Ea ?

En faisant la liaison du substrat ; énergie de liaison

Le site de liaison du substrat est l’ensemble des chaines lat d’aa présent au catalytique sui participe
Le site catalytique est un ensemble de résidus qui font directement la catalyse en transformant le substrat en produit.

Exemple des protéases à Ser comme la chymotrypsine et la trypsine.


Cf cours de M.Sarthoux (http://lv303upmc.googlepages.com/)
Sérine non ionisable mais pas dans ces conditions : triade his, asp et ser. Le pKa baisse à 8 et la sérine perd son proton !! La sérine peut donc attaquer le C chargés + de la protéine slt en présence de his et asp !
Protéolyse fait tjs intervenir une molécule d’eau.

Exemple des deux trioses phosphate de la glycolyse



Dessin 4
Site de liaison catalytique très proche.

Michaelis



E +S = ES =ES# = EP = E + P
ES# => substrat activé, liaison allumée


On a vu que vi =/= (Vm [So])/(Km + [So]) était impossible

Et v = dP/dt = (k+2) [ES] – (k-2) [E][P]

Allons du plus simple au plus compliqué :

Règle :

- qui aboutit à P est affecté d’un signe + car enrichi en P

- qui part de P, appauvrit en P , affecté d’un signe –
Et v = dP/dt = (k+2) [ES] – (k-2) [E][P]

Obj : démontrer équation de Michaelis
vi = (Vm [So])/(Km + [So])= (k+2) [Eo] [So] / ((k+2)+k-1/k+1) +[So])
si k-2 [P][E]=/=

- k-2 =/= 0 (réaction irréversible) en général seulement dans protéolyse

- [E]=/= O

- [P] doit tendre vers 0 => état stationnaire

Etat stationnaire = intervalle de tps petit où P est mesurable mais négligeable càd tend vers 0

Si [So]= 1 mM , alors [P]attendu = 1mM

Si [S] = 0,9 mM alors [P] = 0,1 mM

La limite sup que peut supporter l’éq de michaelis : P représente 10% du P total attendu
Dans ces conditions, la vitesse v = (k+2) [ES]


Conséquences :

  1. v=vi=vo=k+2 [ES]

  2. P 0 => [ES] producteur 0

  3. ES varie peu donc d[ES]/dt ≈ 0


Alors d[ES]/dt = k+1 [E][S] - k-1 [ES] – k+2 [ES]

k+1 [E][S] = (k-1 + k+2) [ES]
=> [E][S] = (k-1 + k+2)/ (k+1) [ES] = KM
vi=vo=k+2 [ES] => [ES] = vi / (k+2)
Pour trouver ES il faut connaitre la [Eo] = [E]+[ES] => [E] = [Eo]-[ES]
([Eo]-[ES])[S] = (k-1 + k+2)/ (k+1) [ES] = KM

[Eo] [S] -[ES] [S] = (k-1 + k+2)/ (k+1) [ES] = KM

[ES] = [Eo] +[S])/ KM +[S]
donc vi = (k+2 [Eo] +[So])/ KM +[So] = Vm [So]/ (Km+[So])
2ème limite de Validité = excès de substrat cad si [Eo]<<[So]

[So] = 1mM

[Eo] = 1µM (c’est déjà trop, 1000 fois plus de substrat que d’enzyme)

si [So] = 5 à 10 KM

KM = [So]  vi = VM/2


Linéarisation (cf cours de sarthoux)



Si on ne respecte pas les conditions de Michaelis




A partir de E ? la vitesse est fausse car on n’est plus dans les conditions initiales avec P qui devient trop grand
v = dP/dt = (k+2) [ES] – (k-2) [E][P] (écart entre théorique et réalité)

Conséquence de la deuxième condition : si [S] excès alors vi = k+2 [ES] = k+2 [Eo]= KM

vi = VM = k+2 [Eo]
VM/KM # kcat/KM = efficacité catalytique
Paramètre du fit :

Pour 1mM ???

Vmax = 50

Km = 0,20

Pour 1nM

Vmax = 60

Km = 0,11



Activité spécifique
k+2 = Vm/[Eo] = (µM de P apparu)/(min)(µM de Eo)= min-1 = Kcat = activité spécifique moléculaire = ASM
si [Eo]est en mg, alors k+2 sera en

k+2 = Vm/[Eo] = (µM de P apparu)/(min)(mg de Eo)= µM de P.min-1 /mg de Eo = activité spécifique = AS
Définition de la constante catalytique
k+2 = kcat = min-1 ou sec-1 = turnover number = nb de cycle substrat donne produit que l’enz effectue par temps

ex : si kcat = 50 sec-1 (normal) , 500sec-1 (rapide)
Quel est le rapport entre kcat et activité spécifique ?
kcat = mole de produit apparu/ (temps*mole de E) = t-1 = ASM
or avec mole de E = masse de E/masse molaire de E = g de E/PM de E (Da)

= 103 mg de E/ PME

kcat = mole de P apparu / (t x 103 mg de E /PME) = mole de P / (((mg de E) x t)(103/PME)) = AS / (103/PME)

kcat = AS / (103/PME)

Notion d’inhibitions réversibles

Inhibiteur compétitif


Analogue au substrat



I inactif

L’affinité de l’ihnibiteur pour l’enz se traduit par le Ki => Ki
L’état stationnaire est défini par :
d[ES]/dt = k+1 [E][S] – k-1 [ES] – k+2 [ES] = 0



or [Eo] = [E] + [ES] + [EI] et [EI] = [E][I] / Ki

d’où [Eo] – [ES] = [E] + [E] [I]/ Ki




KM en présence d’inhibiteur compétitif et VM reste inchangé.



Inhibiteur non compétitif



- peut se lier à l’enz avec la même affinité en présence ou en l’absence de substrat

- site spécifique différent de celui du substrat

- Vm affecté , Km non affecté




Inhibiteurs incompétitifs




La liaison du substrat induit un changement de conf sur l’enz qui permet à l’inhibiteur d’augmenter son affinité pour l’enzyme.

Remarque inhibitions



Cas 1 : C

Cas 2 : IC

Cas 1 + cas 2 = NC
Vi = Vm [So] / (K’m+ [So])
Inhibition est la diminution de la vitesse enzymatique : K’m , vi 
Si substrat en excès K’m devient négligeable. Inhibition compétitive peut être levé par un excès de substrat. Vi = Vm [So] / (K’m+ [So]) = Vm

Vi = Vm [So] / (K’m+ [So])
Dans cas de l’inhibiteur incompétitif, diminue la vitesse initiale en diminuant Vmmais augmente l’affinité en diminuant le Km mais au numérateur (produit et au dénominateur somme ) l’effet est plus important alors la vitesse est tout de même diminué légèrement vi  Vm 

K’m  vi 

Cas inhibiteurs par excès de substrats


Enz concernée ayant deux sous sites a et b ; occupation de a+b= formation du site actif

Si [substrat] en excès les deux sous sites sont occupés par 2 molécules de substrats.


Si [So] petit, [So]² encore plus petit alors vi = Vm [So] / (KM+[So])


Si [So] grand, [So]² encore plus grand alors :vi = Vm [So] /(KM+[So]²/Ki) suite sur feuille




Réactions réversibles



MDH

Malate + NAD+ = oxaloacétate + NADH , H+

| |

CHOH C=O

| |
Schéma mito



d[ES]/dt = k+1 [E][S] – k-1 [ES] + k-2 [E][P] - k+2 [ES] = 0

Equation utilisée pour démontrer la vitesse de la réaction.
[ES] = (E(k+1 [S] + k-2 [P])/ (k-1 + k+2)
vi = dP/dt = k+2 [ES] – k-2 [E] [P]

Si on considère que nous sommes dans la réaction aller : P 0, vi = va = via
…..
Si on considère que nous sommes dans la réaction retour : [S] 0, vi = vr

k-1/k+1  affinité

k+2 dissocie , efficacité catalytique

k-2 associe

Une réaction équilibrée à une vitesse de retour égale à la vitesse aller


vir= VMR [P] / (KMR + [P])

Equation de Haldane qui traduit que tte réaction réversible



vi = 0 à l’équilibre



Réaction à 1 substrat et plusieurs complexes intermédiaires



avec So >> Et (ou Eo)


Etat stationnaire


La vitesse de réaction est :



simplification

Schéma protéase à sérine cf cours sarthoux
E=E-CH2OH : la protéine avec son résidu sérine catalytique

S=R-CO-O-R’ : substrat de la protéine

ES’=E-CH2-O-CO-R : protéine acylée sur son résidu sérine par la partie acide de la protéine substrat : complexe intermédiaire covalente

P=R-CO-O- : le fgt Nt de la protéine substrat avec le groupement carboxyle du résidu –site coupure
Si acylation irréversible => k-2 = 0

au quasi équilibre : KMapp = KD

k+3<

Notion d’étape limitante (vitesse lente)


Acylation limitante et désacylation limitante

k+2 <<on ne peut éliminer k+2 que dans un produit
donc k+2=kcat
si désacylation limitante

Km apparent = Km vrai

Si quasi équilibre

Km= k-1 + k+2/ k+1
Kd= k-1/k+1
…..


Réaction à plusieurs substrats



Schéma 3

Notation de Cleland :



• La majorité des réactions enzymatiques ont deux ou plusieurs substrats
• Terminologie (selon W.W. Cleland 1960):

– Substrates “A, B, C, and D” selon l’ordre de fixation à l’enzyme.

– Produits “P, Q, R, and S” dans l’ordre de dissociation.

– Formes stables de l’enzyme “E, F, G” E étant l’enzyme libre.
• Selon le nombre de substrats/produits Uni (1), Bi (2), Ter (3) et Quad (4).

Une réaction à 1 substrat et 3 produits s’apelle “uni-ter”.
• Réaction catalysée pas l’hexokinase Glu + ATP _ G-6-P + ADP

mécanisme Bi-Bi
Remarque: les réactions chimiques élementaires uni et bimoléculaires sont « normales », trimoléculaires sont rarissimes et tetramoléculaires impossibles (probabilité que 4 molécules se rencontres par diffusion est nulle) . Les enzymes fixent plusieurs substrats donc même des réactions complexes peuvent avoir lieu.
Mécanisme bi-bi ordonné : 2 substrats et 2 produits

Mécanisme bi-ter ordonné : 2 substrats et 3 produits

Il existe des complexes ternaires :

Association non ordonnée (NO) :Réaction séquentielles aléatoire (ex : bibi aléatoire)

A combinaison indépendante (NOCI) :


A ou B se fixe au hasard et ne change rien à la fixation du 2ème substrat



L’affinité de B est la même pour E et EA.
Exemple :


A combinaison dépendante :


Fixation du 1er substrat influe sur la fixation du 2ème substrat




Association séquentielles ordonnée (O), A= substrat obligatoire




Le substrat B se fixe au complexe EA, mais il n’a pas d’affinité pour E.

Mécanisme ping pong (avec complexe ternaire)





Mécanisme:

1. le substrat A se fixe à l’enzyme

2. Une réaction a lieu, P se dissocie, F est très souvent un intermédiare covalent

(NB: distinction entre INTERMEDIAIRE et ETAT DE TRANSITION)

3. Le deuxième substrat B se fixe

4. Réaction, dissociation du deuxième produit


Exemple de la transamination









similaire:

Proteines rappel : Propriétés physico chimiques iconContacts Mme Christel causserand responsable du Master1 parcours Procédés Physico-Chimiques
«vers les procédés Physico-Chimiques» ou d’une licence de Sciences Physiques et Chimiques. Peuvent également postuler des étudiants...

Proteines rappel : Propriétés physico chimiques iconChapitre 3 : les techniques physico-chimiques d’analyse et de caractérisation

Proteines rappel : Propriétés physico chimiques iconRappel : Dégénérescence rétrograde et antérograde
«la chemo-affinité» une étiquette cytochimie qui permettent de reconnaître les fibres. C’est différent de la plasticité ? C’est la...

Proteines rappel : Propriétés physico chimiques iconHistorique Le cadastre dans l’histoire nationale
«littérale» ou «cadastrale» (état de sections, matrices des propriétés foncières devenues ensuite matrices des propriétés bâties...

Proteines rappel : Propriétés physico chimiques iconSurveillance et lutte physico-chimique contre les pollutions; pluies acides

Proteines rappel : Propriétés physico chimiques iconPropriétés

Proteines rappel : Propriétés physico chimiques iconÉquilibres chimiques I. GÉNÉralitéS

Proteines rappel : Propriétés physico chimiques iconSciences physiques et chimiques

Proteines rappel : Propriétés physico chimiques iconOn note Propriétés : Si alors et

Proteines rappel : Propriétés physico chimiques iconSection 2 : Les propriétés du tourisme






Tous droits réservés. Copyright © 2016
contacts
d.20-bal.com